1. Область применения

Метод применим для гранулированного крахмала в нативной и модифицированной форме.

LT 18 Dec 1964
Rev.: LT 30 Aug 1999

2. Принцип

Образец последовательно разбавляют, инкубируют на пептоновом субстрате, пастеризуют и снова инкубируют

3. Аппаратура

3.1 Термостатированный электрический инкубатор

3.2 Пипетка 2000 -3000 микролитров с одноразовыми наконечниками

или стеклянная пипетка

3.3 Пипетка 500 микролитров с одноразовыми наконечниками

или стеклянная пипетка

3.4 Лабораторные весы

3.5 Колба с широким горлом, 100 мл.

3.5 Пробирки для субстрата 160 м x 16 мм с крышками

использовать стерильные одноразовые

3.7 Автоклав

Стерилизовать при 120 +/- 2 ^oC 20 минут.

3.8 Горелка Бунзена

на протяжении всего опыта работать в антисептических условиях

4. Питательная среда

4.1 Пептоновое молоко.

Приготовление пептонового молока

10 г пептона растворить свежем снятом молоке. При необходимости подогреть. Охладить и долить молоком до 1 литра. Добавить 10 мл 1% спиртового раствора бромкрезолпурпура. Растворить 0.8 г цистеингидрохлорида в небольшом количестве воды и нейтрализовать полученный раствор гидроксидом калия 2 Н до pH 7.2 - 7.3. Добавить раствор цистеингидрохлорида в пептоновое молоко.

BACTO пептон или эквивалентный

5. Методика проведения

Налить пептоновое молоко в пробирки прибл. по 10 мл, закрыть и стерилизовать в автоклаве при 115 ^oC в течение 20 минут.

Стерилизованный субстрат хранится 1-2 недели

Разведение I

В асептических условиях взвесить 10 г (W) образца крахмала с точностью до 100 мг, перенести в стерильную колбу 100 мл. Развести до 4^-1 тремя частями стерилизованной воды. Закрыть колбу и энергично встряхнуть.

Крахмал должен быть распределён равномерно по дну колбы

 Разведение II

Развести до 4^-2 3 мл полученного (разведение I) крахмального раствора в пробирке 9 мл стерилизованной воды (A5)

Разведение III

Развести до 4^-3 3 мл полученного (разведение II) крахмального раствора в пробирке 9 мл стерилизованной воды (B5)

Посев

Засеять три пробирки со стерильным субстратом 2 мл каждого из полученных крахмальных растворов (I, II и III) а также засеять три пробирки со стерильным субстратом по 0,5 мл раствора III (получая разведение 4^-4) – получая в общей сложности 12 засеянных пробирок с субстратом.

Пастеризация

Пастеризовать засеянные пробирки при 80 ^oC в течение 20 минут на водяной бане.

 Инкубация

Охладить и инкубировать при 30^oC 4 дня

Подсчёт

Пробирка с субстратом положительная, если после четырёх дней инкубации отмечается рост бактерий. Число термостойких спор определяется по следующей таблице:

6. Вычисления

Записать число термостабильных спор на г

7. Замечание

Стерилизовать посуду в автоклаве при 120 +/-2 ⁰C 20 минут или в горячем воздухе 160 +/-5 ⁰C  2 часа или 140 +/-5 ^oC 3 часа

8. Ссылка

Лабораторный журнал Исследовательского центра Роскилда, стр. 114